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대한생식의학회지 제31권 제1호 2010년
Minimum Volume Cooling 방법을 이용한 효율높은 인간배아줄기세포동결
마리아 기초의학연구소/마리아바이오텍, 충북대학교, 마리아불임병원, 건국대학교
김은영, 박세영,윤지연,길광수,이창현,이건섭,태진철,김남형,이원돈,정길생,박세필,임진호
A New Efficient Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells by a Minimum Volume Cooling Method
Eun Young Kim, Sae Young Park, Ji Yeon Yoon, Gwang Su Ghil, Chang Hyun Lee, Gun Soup Lee, Jin Cheol Tae, Nam Hyung Kim, Won Don Lee, Kil Saeng Chung, Sepill Park, Jin Ho Lim
Maria Infertility Hospital Medical Institute/Maria Biotech, Chungbuk National University, Maria Infertility Hospital, Kon Kuk University
연구목적: 본 연구는 인간배아줄기세포 동결에 minimum volume cooling (MVC) 초자화 동결방법이 유용하게 이용될 수 있는지의 여부를 조사하고자 실시하였다. 연구재료 및 방법: 인간배아줄기세포 콜로니는 0.05% collagenase 처리와 기계적 처리에 의해 작은 clumps로 자른 다음 동결 방법에 따른 효율을 비교 검토하고자, i) 대략 40-50개의 clumps를 10% DMSO가 들어있는 동결액에 5~10분간 처리하여 1ml cryo-vial에 넣고 slow-cooling용 cryo-module에 장착하고 -80C에서 overnight한 후 LN2에 침지하여 완만동결을 실시하거나 ii) 10% ethylene glycol (EG)이 들어 있는 동결액에서 5~10분 처리하고 30% EG과 0.5 mol sucrose가 들어 있는 동결액에서 30초간 처리하여 본 연구를 위해 개발된 MVC straw에 10 clumps씩 적재한 다음 4~5 MVC straw를 LN2가 들어있는 cryo-vial에 넣어 MVC 초자화동결을 실시하였다. 융해 후 생존율을 조사하였고 배아줄기세포의 특성을 유지하고 있는지의 여부를 조사하였다. 결과: 융해 후, 인간배아줄기세포의 생존율은 완만동결을 실시했던 군 (20.0%) 보다 MVC 초자화동결을 실시했던 군에서 (76.0%) 유의하게 높게 나타났다. 또한 회복과정에서 완만동결을 실시했던 군에서는 세포성장이 매우 더디고 안 좋은 반면, MVC 초자화동결을 실시했던 군은 배아줄기세포의 증식이 동결을 실시하지 않은 세포와 같은 상태로 2주 이후부터 빠르게 전환되고 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 더불어 MVC 초자화동결－융해 후 회복된 배아줄기세포에서 정상 핵형, alkaline phosphatase acitivity, SSEA-4와 TRA-1-60 염색 및 Oct-4 발현을 확인하였으며 체외분화의 특성도 확인하였다. 결론: 새로이 개발된 MVC 초자화동결을 이용하면 인간배아줄기세포는 고유의 특성을 잃지 않고 성공적으로 동결될 수 있다.
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키워드 : Human embryonic stem cell, Vitrification, Minimum volume cooling (MVC)
교신저자 : sppark@mariababy.com
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