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대한생식의학회지 제26권 제2호 2010년
원형정자 미세주입에 의한 소 난자의 수정과 체외 배 발달
건국대학교, 동물자원연구센터, 대구대학교 생물공학과
엄진희, 도정태, 김남형, 박흠대, 이훈택, 정길생,
Fertilization and in vitro development of bovine oocytes following round spermtid injection
Um jh, Do jt, Kim nh, Park hd, Lee ht, Chung ks
본 연구에서는 소 난자 세포질내 원형정자 및 원형정자 핵을 미세주입 후 수정과정과 체외 배발달을 조사하였다. 원형정자 주입 3 시간전에 인위적 자극을 주고 원형정자를 주입했을 때 난자들의 수정율이 주입 직후에 자극을 준 것들과 자극을 주지 않은 것들보다 높았다. 원형정자 주입과 원형정자핵을 주입한 후 전핵 형성율과 전핵 이동율을 조사하였으나 유의차를 발견할 수 없었다. 전핵의 형성과 이동중에 미세소관의 움직임을 간접형광면역법 및 공촛점 현미경을 사용하여 조사해본 결과, 난활성 직후 난자의 표층에서 미세소관이 발생해서 이것에 의해 웅성 및 자성전핵이 난자 중심부로 이전됨을 볼 수 있었다. 수정후 원형정자의 세포질내 Mitochondria의 분포상태를 알아보기 위해 MitoTracker에 노출시킨 원형정자를 주입한 후 형광현미경에서 관찰해 보았다. 그 결과 원형정자의 Mitochondria가 주입후 4-cell 이전까지는 관찰되었으나 그 이후에는 발견할 수 없었다. 원형정자를 미세주입한 후 소 난자를 체외에서 배양했을때 2.5%의 난자가 배반포로 발달하였다. 이상의 결과는 체외 배양한 소 난자 내에 원형정자 혹은 원형정자 핵을 미세 주입하여 정상적인 수정과 배 발달이 가능한 것을 보여주는 것이다.
More basic experiments in animals are of great significance for application and improvement of assisted conception methods such as intracytoplasmic sperm (ICSI) or round spermatid injection (ROSI). Because spermatids are unable to activate oocytes, mainly due to lack of the oocyte activation factors, additional activation procedure is required to allow fertilization following spermatid injection in the mouse (Kimura et al., 1995), rabbit (Sofikitis et al., 1996) and pig (Lee et al., 1998). Kimura and Yanagimachi (1995) reported that injection of 'undenuded' mouse spermatid resulted in 14% fertilization with a single electrical stimulation. In contrast, injection of spermatid nucleus into oocytes that have been parthenogenetically activated 1 h before injection resulted in much higher rate of fertilization. This suggests that experimental conditions employed affect fertilization rates following round spermatid or round spermatid nucleus injection. It has been assumed strict maternal inheritance of mammalian mitochondrial DNA (mtDNA). However, paternal midpiece mitochondria enter the egg in the majority of mammals but their ultimate fate is unknown (Ankel-Simons & Cummins, 1996). The mechanisms by which the paternal mitochondria are eliminated are obscure and extremely diverse in eukaryotic organisms (Birky, 1995; Ankel-Simons & Cummins, 1996). If recognition and elimination of the paternal mitochondria are based on recognition by the embryo of elements of the sperm midpiece, then the microinjection of round spermatids, where these elements may not have yet fully formed, may allow paternal mtDNA to evade detection and elimination. This is potentially a concern for human infertility treatment, as the dominance of maternal transmission of mtDNA means that male fitness is irrelevant to the evolutionary 'interests' some of the mitochondrial genome, and some mitochondrial disorders (including perhaps some forms of infertility) are more severe and more prevalent in men than women (Johns, 1996; Cummins, 1997). Despite importance of various animal models for the round spermatid injection in the human clinic, little information is available on this subject for any species other than the mouse. In the present study we determined fertilization processes and developmental ability following injection of round spermatid and round spermatid nuclei.
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