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대한생식의학회지 제26권 제2호 2010년
Nitric Oxide의 농도 의존적인 배발생 억제 효과
부산대학교 분자생물학과, 문화병원 불임클리닉*, 조재동 산부인과의원**
박세희, 주보선*, 문화숙*, 김윤연**, 조재동**, 강호성, 김한도,
Dose-Dependent Inhibitory Effect of Nitric Oxide on Embryo Development
Park sh, Joo bs, Moon hs, Kim yy, Cho jd, Kang hs, Kim hd
목적: 일산화질소(nitric oxide; NO)는 생식계를 비롯한 여러 생체내 기관에서 다양하고도 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 복강액은 난관내강과 연결되어 복강액 내의 세포 성분의 변화는 난관의 미세환경을 변화시켜 수정과 초기 배아 발생에 영향을 줄 수 있다. 본 연구는 배아 발생에 있어서 일산화질소의 역할을 이해하고 복강액내의 NO 농도 변화가 배아 발생에 미치는 역할을 조사하기 위해 수행되었다. 방법: 과배란시킨 1세대 잡종 암컷 생쥐(C57BL×CBA/Ca)로부터 1세포기 배아를 얻어 10% synthetic serum substitute가 첨가된 modified human tubal fluid 배양액에서 4일 동안 체외배양하였다(대조군). 실험을 위해 이러한 배양조건에 sodium nitroprusside (SNP)를 0∼1mM의 다양한 농도로 배양초기부터 첨가하거나, 200 M SNP를 2-, 4-, 8-세포기의 각기 다른 배아 시기에 첨가하였으며, 복강경수술을 받는 42명의 여성으로부터 채취한 복강액을 SSS 대신 단백질원으로 사용하여 포배아까지의 배아 발달율을 관찰하였으며. 복강액 내의 NO 농도를 Griess 방법에 의해 측정하였다. 배아의 apoptotic body는 H33342 염색법으로 조사하였으며 배아 발달율은 3회 이상 반복 실험한 결과의 mean±SEM으로 나타내었다. 결과: SNP는 농도에 의존적으로 배발생을 억제하였으나 배아 단계에 대한 특이성은 관찰할 수 없었으며, 특히 100 M 이상의 고농도의 SNP는 2-세포기 단계에서 배아 발생을 정지시켰다. 또한 단백질원으로 복강액 이용시 배발생율은 복강액 내의 NO 농도에 따라 현저한 차이가 발견되었으며, 2.5 M 이상의 NO를 함유한 복강액에서 배양한 배아의 발생율은 현저하게 감소하였다. cGMP analogue인 8-bromo-cGMP를 배양액에 첨가시 배아 발생에는 변화가 없었으며, SNP에 의해 배발생이 정지된 2-세포기 배아에서 apoptotic body를 발견할 수 없었다. 결론: 이상의 결과로 보아 NO는 고농도에서 배아 발생을 저해하며, 복강액내의 NO와 같은 성분의 변화는 배아 발생에 유해한 효과를 유발할 것으로 사료된다. 이러한 NO의 배아 발생 억제효과는 cGMP로 중재되는 경로나 apoptosis 유발과는 관계가 없는 것 같다.
Approximately 14-40% of infertile couples have infertility caused by immunologic disorders which result from the production of antisperm antibody in humoral immune response1 and the soluble products of activated lymphocytes and macrophages in cellular immune response2,3. Especially, endometriosis which is inflammatory state characterized by the presence and growth of ectopic endometrial tissue outside the uterine cavity, occurs at 20-40% of high incidence in infertile women4. As peritoneal fluid is able to go into the oviductal cavity, changes of cellular and hormonal components within peritoneal fluid may influence the early reproductive processes such as fertilization and early embryo development by modulating the microenvironment that surrounds the embryo5. Peritoneal fluid in women with endometriosis has been reported to increase the number of activated macrophages4 and the production of cytokines such as interleukin-1 (IL-1)6, interleukin-6 (IL-6)7 and tumor necrosis factor- (TNF- )8,9. These cytokines are known to have adverse effects on sperm cell function, fertilization and embryo development10. However, the correct mechanism for this inhibition is unclear. It is an established fact that these cytokines stimulate macrophages to produce nitric oxide (NO) during conversion of L-arginine to L-citrulline by NO synthase11. It has been reported that NO plays important roles in various physiological systems. The physiologic actions of NO are regulating smooth muscle relaxation, platelet aggregation and adhesion, cell growth, neurotransmission, apoptosis and immune response12. Since the cells of these systems are integral parts of the reproductive organs, NO is thought to play an important role in reproduction. Indeed, many studies have demonstrated that NO regulates pulsatile hypothalamic GnRH secretion13, human granulosa-luteal cell steroidogenesis14, ovulation15 and penile erection16. Therefore, it is suggested that the increased production of NO from the activated macrophage by endometriosis or certain other causes may affect directly or indirectly fertilization and embryo development causing infertilty. NO induces cell death via apoptosis or necrosis. This effects of NO were thought to be solely mediated via activation of 3',5'-cyclic guanosine monophosphate (c-GMP)17. However, recent studies have demonstrated that NO can also induce biological effects via non-cGMP dependent pathways18,19. Therefore, this study was performed to understand the effect of NO on embryo development using sodium nitroprusside (SNP), stable NO donor and peritoneal fluids collected from women undergoing laparoscopic operation. NO concentration in PF was measured to determine whether NO level within PF correlates with the embryo development. We also investigated the occurrence of apoptosis following by treatment of SNP and the effect of cGMP analogue on embryo development to understand the mechanism and the pathway for the action of NO.
키워드 : Nitric oxide, Sodium nitroprusside, Peritoneal fluid, Embryo development.
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