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대한생식의학회지 제26권 제2호 2010년
체외성숙, 체외수정 및 체외배양에서 생산된 소 배반포기배의 초자화 동결
마리아 기초의학연구소, 마리아 불임클리닉1
남화경, 김은영, 이금실, 윤산현1, 박세필, 임진호,
Cryopreservation of Bovine IVM/IVF/IVC Blastocysts by Vitrification
Nam hk, Kim ey, Lee ks, Yoon sh, Park sp, Lim jh
본 연구는 체외생산된 소 배반포기배를 발달 단계 및 배양일에 따라 구별하여 초자화 동결 및 융해하였을 때, 그 발달능을 유지하는지 확인하고자 실시하였다. 체외수정 후 8일간 배양된 배반포기배는 20% ethylene glycol에 3분 동안 평형시키고, EFS40 (40% ethylene glycol, 18% ficoll, 0.3 M sucrose 그리고 10% FBS가 함유된 mDPBS) 동결액에 30초 동안 노출한 후, 액체질소에 침지하여 초자화 동결되었다. 체외 생존 여부는 융해 24시간 및 48시간에 재팽창 및 탈출 또는 완전탈출로써 평가하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외수정 후 8일간 배양하였을 때, 난할된 배의 배반포기배로의 발달율은 41.0%였다 (초기; 7.6%, 팽창; 22.9%, 탈출; 4.6%, 완전탈출; 5.9%). 2) 배반포기배를 동결액에 노출 또는 초자화 동결하였을 때, 초자화 동결된 배반포기배의 재팽창율 (73.3%)은 대조군 및 동결액에 노출된 경우 (100, 97.0%) 보다 낮았다 (P<0.05). 그러나 융해 48시간 후 탈출 또는 완전탈출 배반포기배 형성율은 초자화 동결된 경우 (66.7, 46.7%)와 노출된 경우 (66.7, 39.4%)는 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 대조군 (100, 100%)과는 차이를 보였다 (P<0.01). 그러나, 완전탈출까지 발달한 배반포기배의 총 세포수를 조사하였을 때, 각 처리군간의 유의한 차이는 없었다. 3) 배반포기배의 발달 단계에 따른 체외 생존율을 비교하였을 때, 재팽창율은 실험군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (64.5 ∼ 75.6%). 그러나 융해 48시간 후, 탈출 또는 완전탈출로써 평가된 초기 배반포기배의 발달율 (25.8, 9.7%)은 팽창 (69.7, 39.4%) 및 탈출 배반포기배 (53.3, 43.3%)의 발달율보다 낮게 나타났다 (P<0.05). 4) 또한, 배양 7, 8 그리고 9일의 팽창 배반포기배를 초자화 동결하였을 때, 8일 및 9일간 배양된 배반포기배의 재팽창율은 7일간 배양된 경우보다 낮게 나타났다 (7일; 93.9%, 8일; 75.8%, 9일; 87.5%) (P<0.05). 그러나 완전탈출 배반포기배로의 발달율에서는 처리군간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (7일; 36.4%, 8일; 36.4%, 9일; 31.3%). 이러한 결과는 EFS40을 이용한 2단계 초자화 동결 방법이 체외생산된 팽창 및 탈출 배반포기배의 동결에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.
The cryopreservation of mammalian embryos has become an integral part of methods to control animal reproduction (Bautista and Kanagawa, 1998). As an innovative method for embryo cryopreservation, vitrification not only reduced the cooling stage duration to a minimum, but also eliminated any injuries caused by extracellular ice which is a major cause of cell injury (Kasai, 1997). Since the first successful vitrification of mammalian embryos was achieved by Rall and Fahy (1985), many researchers have focused on vitrification of different developmental stages in various species and subsequent production of offspring (Kim et al., 1997; van Wagtendonk-de Leeuw et al., 1997; Martinez and Matkovic, 1998). And after 1990, the cryoprotectant based on ethylene glycol (EG) which permeates the cell rapidly and has low toxicity is widely used. Also, the EG in combination with macromolecules and sugars, EFS has been used successfully for the vitrification of mouse morula and blastocysts (Kasai et al., 1990; Kim et al., 1997), rabbit morula (Kasai et al., 1992), bovine blastocysts (Tachikawa et al., 1993) and ovine morula (Martinez and Matkovic, 1998). Survival of frozen-thawed in vitro produced embryos has been reported to be affected by embryo age, stage of embryonic development, embryo quality, cryoprotectant, pH of the freezing medium, freezing process and culture system (medium and gaseous atmosphere) in which the embryos are produced (Leibo and Loskutoff, 1993; Hasler et al., 1997). The objective of this study was to examine the effect of developmental stage of in vitro produced bovine blastocysts vitrified by EFS.
키워드 : Bovine, Vitrification, EFS40, Developmental stage, Embryo age
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